简化CRISPR 基因编辑的干细胞的工作流程，提高单克隆效率

人诱导多能干细胞iPSC被广泛用于疾病建模、药物开发和疾病的细胞治疗，随着基因编辑技术的进一步发展，对患者的诱导多能干细胞进行基因编辑，校正致病基因的突变并用于细胞治疗正成为转化医学和再生医学研究的热点。CRISPR介导的基因编辑为研究人员提供了一种更快、更有效的方法来编辑细胞中感兴趣的关键基因。虽然比传统方法更有效，但基因组编辑过程通常会损害细胞活力，因此从编辑后的单细胞生长成到单克隆细胞团是一个困难的过程。CRISPR 工作流程的一个主要瓶颈是单细胞克隆。细胞转染后，产生的细胞群是异质的，具有不同程度的编辑。该群体必须从未转染的细胞中富集并克隆以创建统一的单克隆细胞系，以便进一步表征以确保进行正确的基因编辑。此外，必须保证基因变化的安全性和可追溯性，特别是在使用转基因细胞的医疗应用中。这是欧洲药品管理局 (EMA) 和食品药品监督管理局 (FDA) 所要求的。

传统的分选方法如有限稀释法耗时耗力、效率低下；FACS分选的细胞容易受到鞘液压力的影响而受损，导致单克隆率低。同时，这两种方法都无法提供单细胞来源的证明，无法满足监管部门的要求。Cytena公司的单细胞打印机以专利的喷墨式打印技术温和而高效的分选单细胞，简化了基因编辑工作流程，极大的提高了单克隆有效率。

下面小编将分别阐述Cytena 的single cell printer如何提高iPSC的单克隆效率及如何简化基因编辑的MSC的工作流程。

1、背景介绍：CRISPR 基因编辑与人多能干细胞(hPSC)

iPSC是什么？

2006年，日本科学家Yamanaka及其研究小组利用逆转录病毒作为载体，向鼠成纤维细胞中导入4个转录因子，获得在形态、基因和蛋白表达、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干细胞极为相似的细胞，后命名为诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cell, iPSC）。次年，该研究小组又成功将人体细胞重编程为iPSC，允许自我更新和分化成人体几乎所有的细胞类型。

iPSC细胞研究改变了基础研究的方向和趋势，Yamanaka也因“将成熟细胞重新编程，转化为可以分化为多种细胞类型的诱导多能干细胞（iPSC）方面的杰出贡献”成为2012年诺贝尔生理或医学奖共同得主。

iPSC应用领域及研究热点

iPSC的一个关键优势是它们从人类的成体细胞产生，避免了人类胚胎干细胞的伦理争议，在药物发现、疾病建模、细胞治疗中具有广泛的应用。为了进一步发挥人iPSC的应用潜能，通过CRISPR/Cas9基因编辑的方法，将疾病发生的突变引入iPSC，或通过iPSC修复疾病模型中的突变，再分化成不同的细胞进行研究或治疗，是目前iPSC的研究热点¹。

图1：iPSC的研究热点

2、Cytena单细胞打印机在CRISPR 基因编辑的hPSC单细胞分选中的应用

hPSC对培养环境的变化十分敏感，如pH值、渗透压、营养供应、机械应力/剪切力等。在传统的培养条件下，hPSC通常在涂有各种细胞外基质表面上密集生长。在对hPSC基因组编辑过程中，最大的挑战之一是获得阳性单克隆细胞。单个hPSC的生长过程中，减少了细胞和细胞之间、细胞与细胞外基质的接触，容易诱发细胞失巢凋亡，导致单细胞存活率显著下降。一方面，抑制细胞失巢凋亡的产生，会改善单细胞存活率；另一方面，温和的自动化分选系统可以进一步优化阳性单克隆细胞的筛选平台。

德国学者在CurrProtocStemCellBiol上发表文章，分享使用Cytena单细胞打印机分选基因编辑后hPSC单细胞的流程，最终平均每个96孔板获得30~50个单克隆hPSC²。

图2：Cytena单细胞打印机筛选单克隆hPSC流程

2021年5月，Nature Methods首次报道能显著提高hPSC在单细胞克隆过程中存活率的四组分配方CEPT。

相比于流式分选，Cytena单细胞打印机以更温和的筛选技术极大提高了单细胞存活率；并利用单细胞打印机验证CEPT能够提高不同来源hPSC细胞株在转染前后的单克隆细胞的存活率，且没有引起遗传异常³。

图3：Cytena单细胞打印机验证CEPT提高单克隆hPSC活率

• 流式细胞仪和Cytena分选设备分选过程中捕捉喷嘴图片（图3d）；比较小分子Y-27632与CEPT处理后hPSC的单克隆有效率，可以发现CEPT处理后克隆有效率更高(图3b, 3c)；在相同小分子处理下，Cytena分选设备单克隆有效率(图3c, 3d)比流式分选(图3a, 3b)高出~20%
• 后续的实验摸索均使用Cytena分选设备，证实CEPT可以明显提高hPSC单细胞克隆率(图3e, 3f)；与 VN 相比，涂有LN521的并含有 StemFlex 培养基的 96 孔板中的hPSC单细胞生存得更好、迁移能力更强(图3e, 3f, 3g)。
• 随机选取CEPT处理后的单克隆，建系传4代培养后，细胞核型检测均正常，表明CEPT没有引起遗传异常(图3h)。
• 同时，使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑CEPT处理后的hPSC，发现其改善了电穿孔时的细胞存活率(图3i-3l)。

3、Cytena单细胞打印机简化生成 CRISPR 编辑的MSC克隆的工作流程

除了在hPSC的应用外，Cytena单细胞打印机在再生医学领域中被用于简化生成 CRISPR 编辑的间充质干细胞（MSC）克隆的工作流程。

图4：RANKL-KO MSCs工作流程

文献⁴向我们展示了一种高效、高通量的工作流程（图4），该工作流程采用f.sight™单细胞打印机，通过GFP报告基因，用于选择和克隆CRISPR/Cas9编辑以敲除RANKL蛋白的间充质干细胞(MSC)，以进一步增强MSCs在再生医学中的治疗能力。 

图5：Cytena单细胞打印机利用GFP简化筛选阳性单克隆MSCs流程

f.sight^TM的高灵敏度能够检测到编辑后的MSCs的低荧光信号并富集到编辑成功的带绿色荧光信号的细胞（图5A）, f.sight^TM的单细胞分离效率高达93.9±2.7%（n=451）（图5A) 。转染质粒的间充质干细胞（31.3±8%）和未转染的间充质干细胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差异较小，基因编辑过程通常会损害细胞活力，这也表明f.sight单细胞分选过程柔和，因此产生的系统偏差较小（图5B）。

图6：RANKL-KO MSCs增强成骨分化能力

CRISPR/Cas9编辑过的敲除RANKL蛋白的间充质干细胞与野生型MSC展现出类似的形态学。在第21天，将细胞固定并用茜素红染料染色，以观察通常在骨细胞中表现出的钙化。钙化的存在表明RANKL敲除的MSCs仍然保持其成骨特性分化的能力。

最终，获得182个单克隆细胞，选取17个做进一步验证，获得2个成功敲除RANKL基因并表现出增强成骨分化能力的克隆。

参考文献：

1. De Masi C, Spitalieri P et al. Application of CRISPR/Cas9 to human-induced pluripotent stem cells: from gene editing to drug discovery. Hum Genomics. 2020 Jun 26;14(1):25. doi: 10.1186/s40246-020-00276-2

2. Chen Y , Carlos A. T ,  Chen L,et al. A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells. Nat Methods. 18(5), 528–541(2021)

3. Vallone et al. Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub-Cloning of Human Pluripotent Stem Cells, Current Protocols in Stem Cell Biology e123, Volume 55(2020)

4. Gross, Tobias, et al. Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and Emulsion Coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning. Plos one 16 3 e0238330 2021. 

关于Cytena公司

Cytena公司潜心研究单细胞打印机技术多年，不断升级设备功能，以一贯温和的分选原理、更加快速的分选效率、更加简易的操作步骤，助力抗体、细胞治疗、基因治疗、干细胞等研究领域的客户快速搭建单细胞筛选平台。艾贝泰生物科技有限公司作为Cytena的单细胞打印机总代理商，为您提供最优质的售前售后服务。

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